活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢(H2O2,Hydrogen peroxide)、羟基自由基(•OH,Hydroxyl radical)、单线态氧(1O2,Singlet oxygen)、一氧化氮(NO,Nitric oxide)、超氧阴离子(•O2-,Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ,Peroxyl radical)、过氧羟自由基(HOO• ,hydroperoxyl)及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子(ONOO-,Peroxynitrite anion)、ClO-和羟化物等,参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果,在呼吸链中,在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应,在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧:“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2•-)(图1A)。超氧阴离子遇水生成H2O2(图1B),同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成(图1C),生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-(图1D),在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH•(图1E),超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-(图1F)。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。 贝博® BBoxiProbe® 活性氧检测试剂盒是一种利用新型荧光探针BBoxiProbe® O12进行细胞活性氧检测的试剂盒。本试剂盒中的BBoxiProbe® O12 ROS探针为绿色荧光的活性氧探针,具有488 / 520nm的最大激发/发射波长。 贝博® BBoxiProbe® O12 ROS探针在细胞中活性氧存在的条件下,被氧化生成绿色荧光物质,绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比,检测O12产物的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 BBoxiProbe® O系列活性氧探针具有多种颜色可以选择,可根据情况对样品进行多色标记实验。除了本试剂盒的绿色荧光探针,贝博还可以提供红色荧光的活性氧检测试剂盒。 在激发波长488 nm,发射波长520 nm附近,使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、等检测O12产物荧光,从而测定细胞内活性氧水平。 本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的检测。本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂,以便于活性氧的检测。 贝博® BBoxiProbe® 还可以为您提供各种细胞样本、冰冻切片样本的活性氧、活性氮等各种颜色的检测试剂盒产品。
2.可以根据需要分装后冻存。
3.探针为DMSO溶液,在2-8℃时是固体状态,冬季气温较低时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解,从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
2.贴壁细胞
2.背景低,灵敏度高;
3.线性范围宽,使用方便。
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
2.吸头
3.一次性手套
4.荧光检测专用黑色96孔板
2.BBoxiProbe® O12荧光探针在2-8℃时是固体状态,从冰箱取出后恢复至室温,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.荧光探针标记后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。
4.探针标记完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的标记情况是否正常。
5.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间,以减少各种可能的误差。
6.以下操作步骤仅供参考,请根据实际样本情况调整或参考文献。
原位标记:仅适用于贴壁培养细胞。
1. 按照1:1000-2000用无血清培养基稀释O12探针。
2. 去除细胞培养基,用PBS洗细胞一次。
3. 加入适当体积稀释好的O12探针。加入的体积以能充分盖住细胞为宜,通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的O12探针不少于1毫升。
4. 在37℃细胞培养箱内避光孵育20分钟。
5. 用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的O12探针。
收集后标记:悬浮细胞或贴壁细胞消化处理
1. 按照1:1000用无血清培养基稀释O12探针。
2. 离心移除培养基,用PBS洗细胞一次。
3. 细胞收集后悬浮于稀释好的O12探针中,细胞浓度为1*106-2*107/毫升,37℃细胞培养箱内避光孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。
4. 用无血清细胞培养基洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的O12探针。
5. 用无血清细胞培养基重悬细胞。
二、 检测:
对于原位标记探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察,或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
荧光强度强,活性氧强度高。
对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测,用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
使用488nm激发波长,525nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。O12探针的荧光光谱和FITC非常相似,可以用FITC的参数设置检测。
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